1.3方法

1.3.1DNA提取

采用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌基因組，具體方法和步驟參照試劑盒說明書。所提取的菌株DNA利用核酸蛋白分析儀和Qubit熒光定量測定儀檢測基因組DNA的純度和濃度，并送北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行全基因組測序。

1.3.2細(xì)菌全基因組測序及生物信息學(xué)分析

經(jīng)電泳檢測合格的DNA樣品用超聲波破碎儀隨機(jī)打斷成長度約為350bp的片段，經(jīng)末端修復(fù)、加A尾、加測序接頭、純化、PCR擴(kuò)增等步驟完成文庫制備。使用Qubit2.0和Agilent2100對構(gòu)建好的文庫進(jìn)行初步定量和插入片段檢測。插入片段符合預(yù)期后，使用Q-PCR對文庫的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量。文庫檢測合格后采用北京諾禾致源科技股份有限公司的IlluminaNovaSeq6000測序系統(tǒng)進(jìn)行全基因組測序。對illumina測序平臺的數(shù)據(jù)進(jìn)行低質(zhì)量過濾，包括去除無效信號、去除測序接頭和錨定引物序列、去除復(fù)雜序列和重復(fù)序列，從而獲得高質(zhì)量的有效數(shù)據(jù)（CleanData）進(jìn)行后續(xù)分析。使用SOAPdenovo軟件進(jìn)行組裝，用RAST對組裝序列進(jìn)行注釋(http://rast.nmpdr.org)。使用基因組流行病學(xué)中心（CenterforGenomicEpidemiology）CGE的默認(rèn)閾值，對組裝序列進(jìn)行鑒定（http://www.genomicepidemiology.org），利用ThePathosystemsResourceIntegrationCenter（PATRIC）對基因組組成進(jìn)行分析（https://www.patricbrc.org/），利用CGEVirulenceFinder在線數(shù)據(jù)庫對血清分型、MLST分型和毒力基因進(jìn)行分析。

1.3.3特征性基因PCR檢測方法

將提取的CMCC44841基因組DNA定量后，分別進(jìn)行10倍梯度稀釋，得到10-1、10-2、10-3、10-4系列濃度，參照GB4789.6-2016中引物序列和PCR檢測方法，進(jìn)行astA、aggR、pic特征性基因PCR擴(kuò)增和靈敏度檢測，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.3.4標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的生產(chǎn)制備

1.3.4.1EAEC菌體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備

取CMCC44841一代新鮮培養(yǎng)物，劃線接種于TSA平板，36℃培養(yǎng)24h。用無菌棉簽從平板上刮取菌落，加入到含有海藻糖和胎牛血清的凍干保護(hù)劑中，渦旋混勻，用移液槍吸取20μL在低溫下速凍成球，然后于冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥。將凍干后的菌球置于2mL的西林瓶中，利用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行真空壓蓋密封。最終制備成EAEC含量為103CFU/樣品的菌球。

1.3.4.2EAECgDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備

將純度A260/A280為1.7的20µgDNA加入到20ml含有葡聚糖的凍干保護(hù)劑中，用移液槍吸取20μL在低溫下速凍成球，然后于冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥，最終制備成含量為20ng/樣品的菌球。將凍干后的菌球放入2mL的西林瓶中，將膠塞虛掩的蓋在西林瓶上，然后用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行真空壓蓋。

1.3.5標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性測試

1.3.5.1EAEC菌體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性測試

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性研究抽取樣品數(shù)量要求，從制備的一批600瓶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中隨機(jī)抽取20瓶樣品，每瓶樣品充分溶于1mL生理鹽水，使用螺旋涂布儀E50模式在TSA平板上進(jìn)行螺旋涂布，每個樣品2個平行。36℃培養(yǎng)24h后對平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。根據(jù)CNAS-GL003對計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行單因子方差分析，評價(jià)樣品的均勻性。

1.3.5.2EAECgDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性測試

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性研究抽取樣品數(shù)量要求，從制備的一批300瓶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中隨機(jī)抽取10件樣品，向每瓶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品加入100μLddH2O，充分溶解，制備成20ng/100μL濃度的DNA樣品，取2μL作為模板，參照GB4789.6-2016中引物序列和PCR檢測方法，進(jìn)行astA、aggR、pic特征性基因PCR擴(kuò)增。

1.3.6標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性測試

1.3.6.1運(yùn)輸穩(wěn)定性

將制備的EAEC菌體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分別存放于25℃和37℃條件下，EAEC菌體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)模擬實(shí)驗(yàn)周期為7天，分別于1、3、5、7天抽取3個樣品，進(jìn)行含菌量測定。根據(jù)CNAS-GL003中｜-｜≤0.3σ準(zhǔn)則對結(jié)果進(jìn)行穩(wěn)定性評價(jià)。EAECgDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)模擬實(shí)驗(yàn)周期為14天，分別于1、3、5、7、14天抽取3個樣品，對特征性基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，考察樣品的運(yùn)輸穩(wěn)定性。

1.3.6.2儲藏穩(wěn)定性

將制備的EAEC菌體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分別于-20℃、4℃條件下保存2個月。于4℃保存7、14和28天，-20℃保存28和60天，分別抽取3個樣品進(jìn)行菌含量測定，于4℃和-20℃保存28、45和60天分別抽取3個樣品進(jìn)行特征性基因檢測，考察樣品的儲藏穩(wěn)定性。根據(jù)CNAS-GL003中｜-｜≤0.3σ準(zhǔn)則對EAEC標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行穩(wěn)定性評價(jià)。

1.3.7標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的協(xié)作驗(yàn)證

使用上述制備好的樣品，按照國家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)協(xié)作標(biāo)定實(shí)施細(xì)則，發(fā)給3家實(shí)驗(yàn)室，代碼分別為A、B和C，每家實(shí)驗(yàn)室收到10件樣品，參照協(xié)作驗(yàn)證作業(yè)指導(dǎo)書對樣品中EAEC標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及其gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行檢驗(yàn)，包括菌落計(jì)數(shù)和特征性基因檢測。

1.3.8標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使用效果驗(yàn)證

根據(jù)GB29921-2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中致病菌限量》，選擇熟肉制品、乳粉、腐乳、餅干和薯片5種食品基質(zhì)共20份樣品對EAEC標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的使用效果進(jìn)行驗(yàn)證，樣品信息見表1。先將EAEC103CFU濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶于1mL生理鹽水中，每件樣品各稱取2份，25g/份，一份正常檢驗(yàn)，一份加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)100μL，根據(jù)GB4789.6-2016進(jìn)行操作。增菌后劃線分離平板觀察是否有典型菌落生長，并進(jìn)行PCR確認(rèn)。