7、身體之外仿真模擬肽-鋅螯合物腸胃消化吸收及鋅離解率測(cè)量

將制作的肽-鋅螯合物溶解pH2.0，37℃雙蒸水中，充足混合后向在其中加上2％(w/w)的胃蛋白酶，在37℃標(biāo)準(zhǔn)下水浴搖床酶解2h。水解反應(yīng)液用分子結(jié)構(gòu)截流量為500Da的透析袋分析5h，搜集透析液，運(yùn)用原子吸收光度計(jì)測(cè)量在其中分散鋅的成分，點(diǎn)評(píng)肽-鋅螯合物在胃消化過(guò)程中的可靠性，與此同時(shí)搜集透析袋內(nèi)剩下化學(xué)物質(zhì)低溫干燥預(yù)留。

將歷經(jīng)胃蛋白酶消化吸收后的肽-鋅螯合物溶解37℃，pH7．0的溶液中，充足混合后加上2％(w/w)的胰酶，在37℃標(biāo)準(zhǔn)下水浴搖床酶解3h。

接著水解反應(yīng)液用分子結(jié)構(gòu)截流量為500Da的透析袋分析5h，搜集透析液，運(yùn)用原子吸收光度計(jì)測(cè)量在其中分散鋅的成分，點(diǎn)評(píng)肽-鋅螯合物在腸消化過(guò)程中的可靠性，與此同時(shí)搜集透析袋內(nèi)剩下化學(xué)物質(zhì)低溫干燥預(yù)留。

在仿真模擬腸胃消化過(guò)程中，鋅的離解率理解為在腸胃消化過(guò)程中釋放出來(lái)分散鋅的量占消化吸收前opo結(jié)構(gòu)脂肽-鋅螯合物中鋅的總數(shù)量的百分?jǐn)?shù)。

8、肽-鋅螯合物中鋅的微生物使用率

Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)基于25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞培養(yǎng)液為含有10％胎牛血清，1％非必須氨基酸，100U/mL青霉素鈉和0.1mg/mL氨芐青霉素的高糖高熱量培養(yǎng)液。塑造標(biāo)準(zhǔn)為37℃，空氣濕度90％，CO₂濃度值為5％。當(dāng)體細(xì)胞在塑造瓶中遍布80％時(shí)，用含0.5％EDTA的胰酶消化吸收體細(xì)胞，隨后以4-5×105cells/mL的濃度值注射于6孔Transwell塑造板中。

每過(guò)2d換一次細(xì)胞培養(yǎng)液，直到細(xì)胞培養(yǎng)基21d。隨后棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用HBSS清理體細(xì)胞2-3次，在細(xì)胞模型上方和下方各自加上1.5mL和3mLHBSS水溶液。將經(jīng)腸胃消化吸收后肽一鋅螯合物加上高于一切側(cè)，使其終濃度值為1.5mg/mL，接著將加入了試樣的Transwell塑造板在37℃下消化吸收轉(zhuǎn)運(yùn)2h，搜集塑造板下方的水溶液開(kāi)展分析，各自搜集透析液和分析后的保存物，隨后運(yùn)用原子吸收光度計(jì)測(cè)量在其中鋅的成分，與消化吸收以前較為，測(cè)算經(jīng)消化吸收全過(guò)程后分散鋅的成分及螯合物中鋅的微生物使用率。

9、數(shù)據(jù)處理方法與數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)信息結(jié)果表明為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤的方式。選用SPSS19.0(SPSSInc，Chicago，IL)開(kāi)展數(shù)據(jù)分析剖析，運(yùn)用Duncan檢測(cè)剖析每組數(shù)據(jù)信息見(jiàn)的顯著性差異(α=0.05)。

三、結(jié)果與剖析

1、opo結(jié)構(gòu)脂肽的分離純化

opo結(jié)構(gòu)脂水解反應(yīng)物經(jīng)SephadexC25疑膠柱分離出來(lái)后的譜圖如圖所示1所顯示。由圖1得知，共分離出來(lái)獲得4組opo結(jié)構(gòu)脂肽成分，F(xiàn)1和F2成分是由流動(dòng)性相20mM，pH4.0的冰醋酸緩沖溶液過(guò)柱得到；F3和F4成分是由流動(dòng)性相20mM，pH4.0的冰醋酸緩沖溶液和0.5MNaCl一同過(guò)柱得到。本實(shí)驗(yàn)操作中分離出來(lái)opo結(jié)構(gòu)脂肽選用的陰離子互換柱層析，以SPsephadexC-25做為固定不動(dòng)相，在其中以帶負(fù)電的磺酸基(一SO₃H)為關(guān)鍵作用團(tuán)，根據(jù)靜電感應(yīng)相互影響對(duì)化學(xué)物質(zhì)實(shí)現(xiàn)分離出來(lái)。因而，F(xiàn)1和F2成分最開(kāi)始被過(guò)柱出來(lái)，含有較多的負(fù)電；F3和F4成分則含有較多正電。因?yàn)镕3和F4成分的過(guò)柱液中帶有NaCI，這兩成分必須 歷經(jīng)除鹽解決。搜集充足量的肽成分后，調(diào)整pH為7.0，低溫干燥后在一80℃標(biāo)準(zhǔn)下儲(chǔ)放預(yù)留。

2、opo結(jié)構(gòu)脂肽成分的ζ電勢(shì)差

分離出來(lái)獲得的4組opo結(jié)構(gòu)脂成分的外表正電荷特性根據(jù)ζ電勢(shì)差開(kāi)展明確。由圖2得知，從F1到F4成分的ζ電勢(shì)差慢慢提升，各自為-43mV，-32mV，-11mV和3mV，且彼此之間具有著顯著性差異(P＜0.05)。這一測(cè)量結(jié)果與以上opo結(jié)構(gòu)脂肽成分的分離純化相一致，F(xiàn)1和F2成分含有較多負(fù)電，ζ電勢(shì)差較低；F3和F4成分最終從SPsephadexC-25正離子互換填充料上過(guò)柱出來(lái)，所需負(fù)電相對(duì)性較少，因而ζ電勢(shì)差較高。不一樣的ζ電勢(shì)差說(shuō)明opo結(jié)構(gòu)脂肽成分在溶液中可靠性不一樣，與此同時(shí)也會(huì)危害肽與金屬離子中間的相互影響及其產(chǎn)生金屬材料螯合物的可靠性。比如，有專家研究發(fā)現(xiàn)因?yàn)閹в休^多帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)，opo結(jié)構(gòu)脂磷酸肽在pH轉(zhuǎn)變 的標(biāo)準(zhǔn)下依然可以與鐵產(chǎn)生比較穩(wěn)定的一氧化氮合酶。因而，因?yàn)?zeta;電勢(shì)差的不一樣，本實(shí)驗(yàn)操作中剝離獲得的opo結(jié)構(gòu)脂肽成分鰲合鋅離子的功能及其產(chǎn)生肽鋅螯合物的可靠性會(huì)存有很大的差別。

3、opo結(jié)構(gòu)脂肽成分的碳水化合物構(gòu)成

小分子活性肽的通電特性在宏觀經(jīng)濟(jì)上體現(xiàn)了其碳水化合物組合而成的差別。含有負(fù)電的成分帶有相比較多的酸性氨基酸，而含有正電的成分帶有相比較多的堿性氨基酸。選用柱前衍化法對(duì)分離出來(lái)獲得的opo結(jié)構(gòu)脂肽成分的碳水化合物構(gòu)成開(kāi)展剖析，結(jié)果如表1所顯示。F1-F3成分中酸性氨基酸成分高過(guò)偏堿氨墓酸成分。在其中，F(xiàn)1成分中酸性氨基酸(Asp和Glu)成分占總碳水化合物成分的42.64％；F2成分中酸性氨基酸成分占33.84％；F3成分中堿性氨基酸(His、Arg、Lys)成分顯著高過(guò)F1和F2成分，做到15.33％。因而，F(xiàn)1、F2和F3可看作帶負(fù)電的成分，掌電勢(shì)差較低。F4成分中偏堿碳水化合物成分高過(guò)酸性氨基酸成分，堿性氨基酸占碳水化合物數(shù)量的37.90％。F4為帶正電成分，亭電勢(shì)差較高。除此之外，有科學(xué)研究報(bào)導(dǎo)，具備融合二價(jià)金屬離子工作能力的氨基酸殘基包含Asp、Glu、His、Ser、Cys、Asn和Gin，這種氨基酸殘基在4組opo結(jié)構(gòu)脂肽成分中的成分各自為55.5％、40.4％、29.4％和26.1％。再融合碳水化合物構(gòu)成剖析得知，分離出來(lái)獲得的4組opo結(jié)構(gòu)脂肽成分都能夠鰲合鋅離子，而且鰲合鋅的實(shí)力從F1成分到F4成分慢慢變?nèi)酢?/p>