2 水環(huán)境治理中病原菌的無損檢測技術(shù)

近些年，水環(huán)境治理中病原菌的檢驗(yàn)獲得了一定的研究成果，已從單一根據(jù)塑造法的傳統(tǒng)式病原菌檢驗(yàn)方式發(fā)展趨勢至多種多樣生物學(xué)檢驗(yàn)方式 ，這種技術(shù)性的發(fā)生和發(fā)展趨勢為病原菌檢驗(yàn)帶來了新的構(gòu)思。水環(huán)境治理中病原菌無損檢測技術(shù)的發(fā)展趨勢見圖 1。

現(xiàn)階段最大多數(shù)的病原菌檢驗(yàn)方式是塑造法和聚合酶 鏈 式 反 應(yīng) ( Polymerase Chain Ｒeaction， PCＲ) 。這 2 種方式在可選擇性和敏感度層面都很突顯，但塑造法比 PCＲ 法更用時(shí)。一些新起的方式如生物傳感器已經(jīng)研發(fā)中，其以后的發(fā)展趨向是達(dá)到成本低、高可選擇性規(guī)定。轉(zhuǎn)錄組測序因?yàn)閿U(kuò)散系數(shù)高和不必非特異引物設(shè)計(jì)等優(yōu)勢正逐步代替?zhèn)鹘y(tǒng)式檢驗(yàn)方式 ，但也存有差錯(cuò)率高局限。近些年病原菌檢驗(yàn)辦法的檢出限以及運(yùn)用見表 2?，F(xiàn)階段，病原菌檢驗(yàn)方式還存有類似亞種無法區(qū)別、高致病及試品濃縮產(chǎn)生的抑止物等難題，這對新檢驗(yàn)辦法的研發(fā)是很大挑戰(zhàn)。

2． 1 PCＲ 和即時(shí)定量分析 PCＲ PCＲ 是現(xiàn)階段病原菌檢測中運(yùn)用最普遍的分子結(jié)構(gòu)

分子生物學(xué)方式之一，其根據(jù)增加特殊的靶基因序列來進(jìn)行病原菌檢驗(yàn)。關(guān)鍵根據(jù)轉(zhuǎn)性、淬火和拓寬( 淬火和拓寬還可以一起開展) 3 個(gè)流程最后達(dá)到目標(biāo)編碼序列的指數(shù)值變大。我國出入境簽證檢驗(yàn)檢測國家標(biāo)準(zhǔn)( SN/T 1896—2007) 中選用 PCＲ 技術(shù)性對食物中的各種病原菌( 沙門菌、志賀氏菌、橙黃色鏈球菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、單核細(xì)胞增長李斯特氏菌、空腸彎曲菌、腸滲出性腸子埃希氏菌 O157: H7、副血溶弧菌、霍亂弧菌和創(chuàng)傷弧菌) 開展迅速判定檢驗(yàn)。

實(shí) 時(shí) 定 量 PCＲ ( quantitative real-time PCＲ， qPCＲ) 是在 PCＲ 技術(shù)性基本上運(yùn)用瑩光數(shù)據(jù)信號值即時(shí)檢驗(yàn)?zāi)康幕?，根?jù)內(nèi)參或外參法對樣本中的特殊遺傳基因開展定性分析，比基本 PCＲ 更加靈巧。已經(jīng)有大量的科學(xué)研究選用 qPCＲ 方式定量分析病原菌，如大腸桿菌和沙門菌 等。各自選用qPCＲ 方式與傳統(tǒng)式塑造法檢驗(yàn)仙河鎮(zhèn)水質(zhì)采樣中大腸埃希菌和腸 球 菌，發(fā) 現(xiàn) qPCＲ 方式的檢出限能做到1 CFU/100 mL，明顯好于傳統(tǒng)式塑造法。可是 qPCＲ也存有 DNA 回收利用高效率低和對引物設(shè)計(jì)非特異規(guī)定高的難題。除此之外，qPCＲ 在檢測中還遭遇別的一些挑戰(zhàn)，如反映中存有 PCＲ 抑止物。即便小量的PCＲ 抑止物也會延遲時(shí)間繁雜試品的閥值循環(huán)系統(tǒng)( Cq ) ，進(jìn)而造成模版拷貝數(shù)比具體值低。為避免假陰性結(jié)果的發(fā)生，可在 PCＲ 反映中添加對抑止物具備高靈敏的內(nèi)部陽性對照( 如內(nèi)參基因) 開展檢驗(yàn)。除此之外，獲取全過程中殘存的抑止物如胍鹽和甲酸可選用 QuickDrop 和 NanoDrop 光度計(jì)檢驗(yàn)，還可以根據(jù)凝膠電泳明確是不是有 ＲNA、DNA 及蛋白質(zhì)環(huán)境污染。假如試品中帶有蛋白質(zhì)等其它雜物的環(huán)境污染，能夠采用磁珠開展核苷酸提純。此外，qPCＲ 無法識別活菌或死菌，會造成陽性結(jié)果?，F(xiàn)階段，一般 采 用 疊 氮 溴 化 丙 錠 ( propidium monoazide， PMA) 對試品開展前理，進(jìn)而防止陽性結(jié)果的造成。PMA 是一種高寬比感光的 DNA 融合染劑，不可以通過完善的活細(xì)胞質(zhì)，卻能可選擇性地通過不詳細(xì)的死細(xì)胞質(zhì)。PMA 能與 DNA 融合產(chǎn)生不可逆化學(xué)鍵，抑止死細(xì)胞 DNA 的增加以做到區(qū)別死、體細(xì)胞的目地。

除此之外，PCＲ 與 qPCＲ 針對病原菌的大批量檢驗(yàn)存有一定的局限。對于以上難題，多種 PCＲ、微滴 式 數(shù) 字 PCＲ 等技術(shù)性陸續(xù)造成。多 重 PCＲ ( multiplex PCＲ，mPCＲ) ，又被稱為多種引物設(shè)計(jì) PCＲ 或復(fù)合型 PCＲ，是在同一 PCＲ 反映管內(nèi)與此同時(shí)再加上多種多樣非特異引 物 進(jìn) 行 PCＲ 擴(kuò) 增。微 滴 式 數(shù) 字 PCＲ ( Droplet Digital PCＲ，ddPCＲ) 是第三代 PCＲ 技術(shù)性，歸屬于單分子結(jié)構(gòu)剖析，可用以肯定定量分析。用 ddPCＲ 和 qPCＲ 記數(shù)江河自然環(huán)境中的沙門菌，發(fā)覺水里 ddPCＲ 的精確度和線形范疇與 qPCＲ 非常，但堆積物試樣中 ddPCＲ 的精確度和線形范疇顯著高些。多種 PCＲ 和微滴式數(shù)據(jù) PCＲ 技術(shù)性都解決了傳統(tǒng)式 PCＲ 方式高成本費(fèi)、擴(kuò)散系數(shù)比較有限、步驟繁雜、精準(zhǔn)度劣等缺陷?？墒?mPCＲ 存有多總體目標(biāo)增加標(biāo)準(zhǔn)不兼容的難題，ddPCＲ 檢驗(yàn)濃度較高的試品時(shí)的線性顯著降低。

2． 2 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)性

近些年新發(fā)展起來的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)性，不論是操作過程或是儀器設(shè)備規(guī)定層面都比 PCＲ 技術(shù)性更加簡潔便捷，在臨床醫(yī)學(xué)和當(dāng)場檢測中有著優(yōu)良的市場前景，在其中，環(huán)受體等溫?cái)U(kuò)增( LAMP) 早已獲得一定的運(yùn)用。該技術(shù)性是一種新式的核苷酸增加方式，其具體機(jī)理是應(yīng)用 4 條非特異引物設(shè)計(jì)各自鑒別靶DNA的 6 個(gè)特殊地區(qū)，根據(jù)鏈置換反應(yīng)完成等溫過程標(biāo)準(zhǔn)下遺傳基因的迅速增加。該辦法的特點(diǎn)是敏感度高( 檢出限比傳統(tǒng)式的 PCＲ 方式低 2 ～ 5 個(gè)量級) 、反應(yīng)速度短( 30 ～ 60 min) 、臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用不用獨(dú)特儀器設(shè)備和使用簡易( 反映液、酶和模版的溶液放置 63 ℃ 上下恒溫水浴鍋或恒溫箱中 30 ～ 60 min) 。應(yīng)用改性材料的 LAMP 定性分析地面中的大腸埃希菌和傷寒論沙門菌，敏感度采樣率為 0． 3 ～ 10 000 cells/mL，濃度較高的抑止物對定量分析結(jié)果危害較小，且 1 h 內(nèi)可以進(jìn)行檢驗(yàn)。LAMP 技術(shù)性根據(jù) 4 ～ 6 個(gè)引物設(shè)計(jì)的融合，因此比 qPCＲ 增加高效率低，也經(jīng)常因非特異性增加發(fā)生陽性結(jié)果。現(xiàn)階段較常用的避免陽性結(jié)果產(chǎn)生的辦法具體包含:

( 1) 應(yīng)用特殊構(gòu)造的PCＲ 管，該管內(nèi)有一個(gè)穩(wěn)定的小擋板將管分為 2 個(gè)地區(qū)，各自添加反映液和 DNA 染劑，但這些辦法提升了加液頻次，不適感用以大批檢驗(yàn);

( 2) 將染劑包埋在石臘中，反映完成后高溫熔融石臘從而釋放出來染劑，但該方式提升了前解決時(shí)間。